杨万颖 祝仁发 李传礼 赖心田 杨国武
(深圳市计量质量检测研究院，广东深圳，518131)
摘要：目前常用的阪崎肠杆菌的分离鉴定方法存在许多不足。通过改进目前常用方法，使得选择性大大提高，可疑菌落易于识别.检测周期缩短，可检测出仅含1个阪崎肠杆菌的接种样品。改进方法与原标准方法的定性验证实验结果-致，定量重复实验结果良好。用改进方法开展市场上婴幼儿奶粉、婴幼儿补充食品中的阪崎肠杆菌污染情况调查，婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌检出率为7.3％，婴幼儿补充食品中阪崎肠杆菌检出率为25％。
关键词：阪崎肠杆菌 检测 质量调查
1 前言
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakf)存在于婴儿奶粉及含乳的婴儿配方食品中，可导致婴儿脑膜炎、败血症、坏死性小肠结肠炎，发病婴儿的死亡高达80％。因此对婴儿奶粉及制品中阪崎肠杆菌进行监测十分重要。目前还没有阪崎肠杆菌检测的国家标准，-般采用的方法是2002年FDA的推荐方法。2005年我国虽颁布了SN/T1632.1行业标准，其分离培养阪崎肠杆菌的方法也基本沿用了FDA的推荐方法。这两个方法所需时间长，分离平板(VRBGA)的选择效果不明显，可疑菌落不易识别，给检测技术人员带来极大的工作量与不确定性。因此，对阪崎肠杆菌分离培养方法进行改进十分必要。
2 材料与方法
2.1菌株
阪崎肠杆菌标准株(45001)购自中国药品生物制品检定所，非阪崎肠杆菌(大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌共l0株)购自中国药品生物制品检定所或由本室保存。
2.2试剂
肠道增菌肉汤(EE肉汤)、VRBGA分离培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、脑心琼脂购自北京陆桥生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；抗生素购自Amresco公司，API20E生化试剂条、氧化酶试剂购自生物梅里埃公司。
VC选择性显色培养基配方：脑心浸粉38.0g、氯化钠5.og、5-溴-4氯-3-吲哚-a-D葡萄糖苷0.1g、万古霉素4mg、头孢噻吩0.1mg、琼脂粉1.5g、蒸馏水1000mL。
2.3方法
前增菌、增菌、分离培养及判定方法同SN/T1632.1。从增菌液中分离阪崎肠杆菌时使用VC选择性显色培养基，培养条件为36M~C、24~：2h，可疑菌落呈蓝绿色、圆形、直径1-2mm 。
鉴定试验：从每个VC选择性显色培养基平板挑选可疑菌落，同时进行革兰氏染色、氧化酶试验、TSA色素形成实验、API20E生化鉴定实验。其它同SN/T1632.1。
3 结果
3.1 VC选择性显色培养基的选择性
将阪崎肠杆菌和10株非阪崎肠杆菌涂布在VC选择性显色培养基上，37℃培养24h，结果发现阪崎肠杆菌能生长，而10株非阪崎肠杆菌中，除产气肠杆菌有生长外，其他9株非阪崎肠杆菌均未生长。产气肠杆菌虽有生长，但菌落呈土黄色，与阪崎肠杆菌菌落容易区分。
3.2改进方法检测实际样品的灵敏性
为观察改进后的方法检测实际样品的灵敏性，人工定量污染阪崎肠杆菌到奶粉样品，用VC选择性显色培养基和SN/T 1632.1-2005中的VRBGA平板进行对照检测。过程如下：取新鲜培养的阪崎肠杆菌菌液依次10倍稀释至10-11，每个稀释度同时做菌落计数；取8个无菌三角瓶，分别加入10g奶粉样品(已确认无阪崎肠杆菌)和90mL无菌水，再分别添加lmL不
同稀释梯度的菌液(稀释度从10-4～10-11)，37℃培养18h；取10mL培养液到90mL EE增菌肉汤，37℃培养18h；接种增菌液到VC显色平板及VRBGA平板各1份，37℃培养18h；取可疑菌落进行API20E生化鉴定。检测结果表明，VRBGA平板上有杂菌生长，而VC选择性显色培养基成功抑制了杂菌，增强了特异性。实验表明，使用VC选择性显色培养基可检测出仅含1个阪崎肠杆菌的接种样品，显示了良好的灵敏性。
3.3定性验证实验
用改进方法定性检测了14份奶粉样品(样品接种量为100g)，结果3份样品检测出阪崎肠杆菌，见表1。同时，用SN/T1632.1-2005标准方法，得到同样结果，见表2。表明改进后的阪崎肠杆菌分离培养方法简便、快速，结果准确、可靠，在实践中可行。
3.4定量重复性实验
选用阪崎肠杆菌阳性的奶粉样品，用改进方法来定量检测其中的阪崎肠杆菌，重复5次，以分析其重复性。结果分别为23、21、23、23、20个/kg，表明实验重复性良好。
3.5市场上婴幼儿食品中的阪崎肠杆菌污染情况调查
用改进方法定量检测婴幼儿食品中的阪崎肠杆菌，开展市场上婴幼儿奶粉、婴幼JL~ITM充食品中的阪崎肠杆菌污染情况调查。从市场上随机购买了55份婴幼儿奶粉，有4份样品检测出含有阪崎肠杆菌，检出率为7.3％；从市场上随机购买了20份婴幼儿补充食品，有5份样品检测出含有阪崎肠杆菌，检出率为25％。婴幼儿补充食品中阪崎肠杆菌的污染水平远高于婴幼儿奶粉。
4 讨论
2002年美国FDA推荐分离培养方法步骤大致为：预增菌(1d)-避择性增菌(1d)-避择性平板(VRBG)分离(1-2d)-可疑菌落产生色素能力的检测(2d)→形态学观察→API 20E生化鉴定(1d) →结果汇报，全过程-般需要9d以上。原因是方法的选择性太低，可疑的阪崎肠杆菌菌落不容易识别，需依次将非阪崎肠杆菌排除，才能进行后面的实验。而用本研究建立的检测方法，因VC显色选择性平板的选择性大大提高，可疑的阪崎肠杆菌菌落易于发现，样品通过无菌水预增菌、EE肉汤增菌处理后，接种到VC选择性显色培养基，可直接挑选蓝绿色菌落同时做生化鉴定、革兰氏染色、氧化酶实验、TSA显色实验，全过程只需要5d。
在VC选择性显色培养基中，万古霉素主要是抑制革兰氏阳性菌，头孢噻吩是广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有-定抑制效果，但阪崎肠杆菌对它们耐药。因此选择这两种抗生素组合起到了很好的抑制杂菌作用。虽仍然有少数杂菌(如产气肠杆菌等)无法抑制，但在培养基中添加了显色剂后，能生长的杂菌菌落基本上不会呈显蓝色，可与阪崎肠
杆菌菌落区分，从而进-步增强了选择性。由于目前市场中显色剂价格昂贵，为了降低成本，实验时可不在选择性培养基中添加显色剂，分离效果-样，只是可疑菌落的识别可能会受到-点点影响。
在基础培养基中加入5-溴-4氯-3-吲哚-a-葡萄糖苷，是利用阪崎肠杆菌的a-D-葡萄糖苷酶活性使阪崎肠杆菌菌落在显色培养基上成蓝绿色菌落。但其他-些细菌在显色培养基上也能产生相似颜色，如伤口埃希氏菌、克氏柠檬酸杆菌在显色培养基上产生蓝绿色菌落，非脱羧勒克氏菌菌落中心呈蓝色四。可见单靠显色剂并不能达到区分阪崎肠杆菌和杂菌的目的。这-点在实际工作中也得到证实。
原阪崎肠杆菌分离培养方法用VRBGA平板来分离阪崎肠杆菌，该培养基含有酵母粉、蛋白胨、葡萄糖等成分，营养非常丰富，阪崎肠杆菌在该培养基上疯狂生长成片状，常掩盖了杂菌的存在，不利于可疑菌落的分离，易导致下-步鉴定的失败。而本研究建立的VC选择性显色培养基，营养适中，且包含适当浓度的抗生素，能抑制阪崎肠杆菌的过度生长但不影响其检出水平，菌落大小适度，菌落形态规则，菌落之间有明显间隙便于挑选。婴儿奶粉污染阪崎肠杆菌的原因是由于婴儿奶粉及配方婴儿食品在加工过程中需加入各种不耐热的营养成分，不是完全无菌的产品，加工过程中的加热处理也不能让产品彻底灭菌，成品中仍可能残留部分来自于原料的阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌还可能来自厂房环境、奶粉消毒后添加微量元素的过程或配方粉的冲调期。研究证明，阪崎肠杆菌在婴儿配方粉中可长期存活。阪崎肠杆菌增殖能力很快，如37℃、19～21min就可分裂一代。对阪崎肠杆菌进行危害性评估发现，与对照相比，25℃放置6h该菌的相对危险性可增加30倍，放置10h可增加30000倍。因此，即使婴儿配方粉中只有极微量的阪崎肠杆菌污染，在配方粉食用前的冲调期和储藏期，该菌也可能会大量繁殖。婴儿配方粉中微量的阪崎肠杆菌(<0.3个/ )污染，也能导致感染的发生。因此，政府主管部门应督促企业加强婴幼儿相关食品中的阪崎肠杆菌污染控制的工作。
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